Методические указания МУК 4.2.2428-08 “Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста” (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 октября 2008 г.)
Методические указания МУК 4.2.2428-08
“Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста”
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 октября 2008 г.)
Дата введения: 15 декабря 2008 г.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Enterobacter sakazakii - возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста, при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.
1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1.3. Контролю на наличие бактерий Е. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.
1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие Е. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей I года жизни, в первую очередь недоношенных, новорожденных с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных Е. sakazakii, том числе при очень низких уровнях возбудителя (1-10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь Е. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.
1.5. Предлагаемый метод определения бактерий Е. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-2001 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие Методические указания также предусматривают определение количества Е. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).
1.6. Обнаружение Е. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни; или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.
2. Сущность метода
2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Ниже представлена методическая схема определения Е. sakazakii.
Таблица 1.
Схема исследования сухих детских смесей на наличие Е. sakazakii
Этап | Продолжительность инкубации, ч | температура |
---|---|---|
1. Подготовка реактивов и материалов | ||
2. Растворение навесок в стерильном фосфатном буфере (ФБР) в соотношении 1:10 (при необходимости определения количества - навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ФБР каждая), смешивание и инкубация | 18-24 | 36.С |
3. Посев проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация | 18-24 | 36.С |
4. Пересев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG agar) или агар Эндо; | 18-24 | 36.С |
5. Отбор 5 подозрительных на E.sakazakii колоний с поверхности VRBG агара или Эндо, пересев на триптонсоевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация | 48-72 | 25.С |
6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности. | ||
7. При необходимости - подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из засеянных навесок продукта. |
2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к виду Е. sakazakii. Подтверждение принадлежности к E.sakazakii производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф. «БиоМерье», Франция) и др.
Определение биохимических характеристик, дифференцирующих Е. sakazakii от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.
Таблица 2
Биохимическая дифференциация Enterobacter sakazakii
Тест или субстрат | Реакции | ||
---|---|---|---|
Е. sakazakii | Е. cloacae | P. agglomerans | |
Лизиндекарбоксилаза | - | - | - |
Аргининдигидролаза | + | + | - |
Орнитиндекарбоксилаза | + | + | (-) |
Подвижность | + | + | (+) |
Утилизация цитратов | + | + | + |
Реакция с метиловым красным | - | - | - |
Реакция Фогес-Проскауэра | + | + | (+) |
Индол | - | - | (-) |
Глюкоза | + | + | + |
Лактоза | + | + | (+) |
Сахароза | + | + | (+) |
Дульцит | - | - | (-) |
Адонит | - | (-) | - |
Раффиноза | (+) | + | (+) |
D-сорбит | - | + | (+) |
альфа-метил-D-глюкозид | + | (+) | - |
мальтоза | + | + | + |
Маннит | + | + | + |
Разжижение желатины (22.С) | - | - | + |
Мукоидный рост | + | + | + |
Желтый пигмент при 24.С | + | - | (+) |
Примечания:
«+» - 90-100% штаммов положительные; «(+)» - 21-89% штаммов положительные;
«-» - 0-9% штаммов положительные; «(-)» - 10-24% штаммов положительные.
Ведущими дифференцирующими признаками Enterobacter sakazakii от других представителей вида Enterobacter являются способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при оптимальной температуре 25.С и отсутствие ферментации D-сорбита. Для дифференциации E.sakazakii от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.
В качестве дополнительного теста при идентификации E.sakazakii возможно определение *-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 4-нитрофенил-*-d-глюкопиранозид или 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-*,d-глюкопиранозид.
Нумерация разделов приводится в соответствии с источником
4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды
4.1. Аппаратура и инструментарий
Наименование аппаратуры и материалов | Названия нормативных документов (ГОСТ, ТУ) |
---|---|
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН+-0,01 | ГОСТ 19881-74 |
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160+-5).С | ТУ 64-1-28-70-76 |
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37.С с отклонением от заданной +-1.С | ТУ 64-1-1382-83 |
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5.С с отклонением от заданной +-1.С | ТУ 64-1-1382-83 |
Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г | ГОСТ 24104-88 |
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС | ГОСТ 8284-78 |
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные | ГОСТ 19569-89Е |
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с | ГОСТ 6709-72 |
Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2», «Стомайкер», или других наименований | AES Lab., Cat.N AESAP 1066 |
Гомогенизатор типа «вортекс» | |
Микропипетки на 200-1000 мкл | DIOHIT, Cat.N 720040 или «Ленпипет» |
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов | ТУ-16-535-84 |
Холодильник бытовой электрический | ГОСТ 16317-87 |
Пинцет медицинский | ГОСТ 21241-89 |
Ножницы медицинские | ГОСТ 21239-89 |
Скальпель хирургический, 15 см | ГОСТ 21240-89 |
Часы механические сигнальные | ГОСТ 3145-84 |
Электроплитка | ГОСТ 14919-83 |
Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания) | ТУ 64-1-2451-78 |
Взамен ГОСТ 24104-88 постановлением РФ от 26 октября 2001 г. N 439-ст с 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001
4.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
---|---|
Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости | ГОСТ 1770-74 |
Воронки стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 5556-81 |
Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
Стекла предметные для микропрепаратов | ГОСТ 6672-75 |
Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100.С (цена деления шкалы 1.С) | ГОСТ 13646-68 |
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
Пакеты стерильные для гомогенизатора | AES Lab., Cat.N AES400/50G |
Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности N 10 | ГИСК им. Л.А. Тарасевича, МЗ РФ |
Денситометр для бактериальных суспензий типа «Densi-La-Meter» или «Денсимат» | ф. «Лахема», «BioMerieux» |
стандарт Макфарланда NN 1, 2, 3 | ф. «BioMerieux» |
Петля бактериологическая |
4.3. Реактивы и питательные среды
Агар микробиологический | ГОСТ 17206-84 |
---|---|
Вода дистиллированная | ГОСТ 6709-72 |
D-глюкоза, ч. | ГОСТ 6038-79 |
D-лактоза, 1-водная | ТУ 6-09-22-98-79 |
Маннит | |
D-сорбит | |
Рамноза | |
Калия гидроокись | ГОСТ 24363-80 |
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч. | ГОСТ 4198-75 |
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | ГОСТ 2493-75 |
Кислота соляная, х.ч. | ГОСТ 3118-77 |
Литий хлористый, ч. или х.ч., или ч, д.а | ГОСТ 4328-77 |
Масло иммерсионное для микроскопии | ГОСТ 31739-78 |
Набор реактивов для окраски по Граму | |
Натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч. | ГОСТ 4170-78 |
Натрия гидроокись, ч.д.а | ГОСТ 4328-77 |
Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а | ГОСТ 22280-75 |
Натрий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а | ГОСТ 4233-77 |
Пара-диметиламидобензальдегид, ч. | ТУ 6-09-3272-77 |
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей | ГОСТ 13805-76 |
Спирт этиловый ректификованный технический | ГОСТ 18300-87 |
Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962-67 |
Феноловый красный | ГОСТ 5853-51 |
Фенолфталеин | ГОСТ 5850-72 |
Фуксин основной | ТУ 6-09-4119-75 |
Хлороформ технический | ГОСТ 2-15-76-72 |
Уксусная кислота | ГОСТ 61-75 |
Сульфаниловая кислота | |
А-нафтол | |
Цинк порошкообразный | ГОСТ 3640 |
Желатин сухой | |
Экстракт дрожжевой сухой | |
Тест-штамм Entervbacter sakazakii, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам | ГИСК им. Л.А. Тарасевича |
Пептонная вода забуференная - (сухая) | |
Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон | ФС42-3377-97 (ГНЦПМ) |
Питательный бульон и питательный агар | ТУ 10-02-02-789-176-94 |
Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) | HiMediaM1214 |
Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) | HiMediaM1263 |
Среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, рамнозой, дульцитом, адонитом, сахарозой, сорбитом | ФС (ЦНИИВС им. И.И. Мечникова, НИИ питательных сред) |
SIM-агар (сероводород-индол-подвижность) | Difco |
Среда Эндо | ТУ 9229-072-00419785 |
Агар желчный фиолетово-красный | ТУ 9229-072-00419785 |
Среда Кесслер с глюкозой | ГОСТ 30519-97 |
Бульон Мак-Конки с глюкозой | ГОСТ 30519-97 |
Бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой | ГОСТ 30519-97 |
Тест-системы биохимические для видовой идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32Е для идентификации Enterobacteriaceae и других грамотрицательных палочек | BioMerieux |
Набор реактивов для окраски по Граму | |
Набор для постановки оксидазного теста |
Примечание: Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.
Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29 000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
5. Подготовка к анализу
5.1. Приготовление растворов и реактивов
5.1.1. Пептонно-солевой раствор | По ГОСТ 26669-85 |
---|---|
5.1.2. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия | По ГОСТ 26669-85 |
5.1.4. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов по Граму | По ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению |
5.1.6. Стерильный фосфатный буфер с рН 7,2+-0,1 | КН2РО4 - 0,45 г, Na2HPO4 - 5,34 г в 1000 см3 дистиллированной H2О, стерилизовать при температуре 121.С в течение 30 мин |
5.2. Приготовление питательных сред
5.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 4.3., готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
5.2.4. Питательный агар с 5% глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».
5.2.5. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.
Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.
Компоненты растворяют в 1000 * дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН * и автоклавируют при 121.С в течение 15 мин.
Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8.С.
5.2.6. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 * дистиллированной воды, устанавливают рН *, разливают в пробирки по 5-7 * и стерилизуют при 121.С в течение 15 мин.
5.2.7. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 * дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают рН *, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, «ВР» и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112.С в течение 20 мин.
6. Отбор и подготовка проб к анализу
6.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец.
6.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем, чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.
6.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.
6.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».
6.5. При отсутствии роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном посеве 50 г, 2 навески по 137,5 при первичном посеве 25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 7.
7. Проведение анализа
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
7.2. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в фосфатный буферный раствор (ФБР) или изотонический раствор (п. 4.3.) в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (*).С в течение (*) ч.
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
7.3. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (*).
Из подготовленной по п. 6. пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (*) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 * ФБР и перемешивают.
Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (*) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (*) и производят посев в 90 см3 ФБР и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (*) и производят посев в 9 * ФБР. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком содержании Е. sakazakii в продукте) меньших количеств продукта - 0,1 г, 0,01 г делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 * (х 3) соответствующих разведений в 9 * ФБР.
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
7.2.1. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 10 * суспензии (1 * - при первичном засеве 1 г или 1 *)) пересевают в 90 * (9 *) жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 30519-97 - среду Кесслера с глюкозой, или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре (*).С в течение (*) ч.
7.2.2. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально-диагностических сред по п. 4.3., Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
Посевы термостатируют при температуре (*).С в течение 24 ч.
7.2.3. При отсутствии роста на чашках с дифференциально-диагностическими средами типа агара Эндо или агара желчного фиолетово-красного анализ прекращают и дают заключение об отсутствии E.sakazakii в исследованной пробе.
7.3. При обнаружении на чашках лактозоположительных колоний дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты, для чего отбирают по 3 - 5 колоний каждого типа для их дальнейшего изучения.
7.4. Отобранные для исследования 3-5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом по п. 4.3. и термостатируют при температуре 25.С в течение 72 часов. В качестве положительного контроля используют референс-штамм Е. sakazakii, типичный по фенотипическим свойствам.
7.5. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Enterobacter sakazakii.
8. Подтверждение принадлежности выделенных культур к Enterobacter sakazakii
8.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E.
8.2. К бактериям Enterobacter sakazakii относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в таблице 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии E.sakazakii обладают *-глюкозидазной активностью.
9. Учет результатов
9.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.
9.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.
При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.
9.3. Учет результатов при количественном определении.
Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий Е. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу 1, приведенную в Приложении 1, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий Е. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (*) продукта.
Для окончательного определения НВЧ бактерий Е. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием Е. sakazakii. Так, в случае, если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (*) (х 3) продукта, количество Е. sakazakii в 1 г (*) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (х 3), количество Е. sakazakii в 1 г (*) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10.
Пример: Бактерии Е. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной - при посеве 1 г.
Рис. 1
Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий Е. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (таблица 1 Приложение 1). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий Е. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта.
Если значение НВЧ по таблице 1 составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.
10. Требования безопасности
Исследования пищевых продуктов на наличие Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
11. Нормативные ссылки
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
10.1. ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae».
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
10.3. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
10.4. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований».
10.5. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
10.6. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».
10.7. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
10.15. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
10.16. СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».
Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником
10.18. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».
Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации |
Г.Г. Онищенко |
Приложение 1
Таблица 1 - Таблица для расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов
Число секторов с подтвержденным ростом Е. sakazakii. (из трех выбранных значений массы (объема) | НВЧ КОЕ/г (см3) | Действительное число микроорганизмов В 1 г (см3) с вероятностью | |||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
1,0 | 0,1 | 0,01 | 95% | 99% | |||
от | до | от | до | ||||
0 | 0 | 0 | <0,30 | 0,00 | 0,94 | 0,00 | 1,40 |
0 | 0 | 1 | 0,30 | 0,01 | 0,95 | 0,00 | 1,40 |
0 | 1 | 0 | 0,30 | 0,01 | 1,00 | 00 | 1,60 |
0 | 1 | 1 | 0,61 | 0,12 | 1,7 | 0,05 | 2,50 |
0 | 2 | 0 | 0,62 | 0,12 | 1,70 | 0,05 | 2,50 |
0 | 3 | 0 | 0,94 | 0,35 | 3,3 | 0,18 | 4,60 |
1 | 0 | 0 | 0,36 | 0,02 | 1,70 | 0,05 | 2,50 |
1 | 0 | 1 | 0,72 | 0,12 | 1,70 | 0,05 | 2,50 |
1 | 0 | 2 | 1,1 | 0,4 | 3,5 | 0,2 | 4,6 |
1 | 1 | 0 | 0,74 | 0,13 | 2,00 | 0,06 | 2,7 |
1 | 1 | 1 | 1,1 | 0,4 | 3,5 | 0,2 | 4,6 |
1 | 2 | 0 | 1,1 | 0,4 | 3,5 | 0,2 | 4,6 |
1 | 2 | 1 | 1,5 | 0,5 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
1 | 3 | 0 | 1,6 | 0,5 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
2 | 0 | 0 | 0,92 | 0,15 | 3,50 | 0,07 | 4,60 |
2 | 0 | 1 | 1,4 | 0,4 | 3,5 | 0,2 | 4,6 |
2 | 0 | 2 | 2,0 | 0,5 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
2 | 1 | 0 | 1,5 | 0,4 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
2 | 1 | 1 | 2,0 | 0,5 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
2 | 1 | 1 | 2,0 | 0,5 | 3,8 | 0,2 | 5,2 |
2 | 1 | 2 | 2,7 | 0,9 | 9,4 | 0,5 | 14,2 |
2 | 2 | 0 | 2,1 | 0,5 | 4,0 | 0,2 | 5,6 |
2 | 2 | 1 | 2,8 | 0,9 | 9,4 | 0,5 | 14,2 |
2 | 2 | 2 | 3,5 | 0,9 | 9,4 | 0,5 | 14,2 |
2 | 3 | 0 | 2,9 | 0,9 | 9,4 | 0,5 | 14,2 |
2 | 3 | 1 | 3,6 | 0,9 | 9,4 | 0,5 | 14,2 |
3 | 0 | 0 | 2,3 | 0,5 | 9,4 | 0,3 | 14,2 |
3 | 0 | 1 | 3,8 | 0,9 | 10,4 | 0,5 | 15,7 |
3 | 0 | 2 | 6,4 | 1,6 | 18,1 | 1,0 | 25,0 |
3 | 1 | 0 | 4,3 | 0,9 | 18,1 | 0,5 | 25,0 |
3 | 1 | 1 | 7,5 | 1,7 | 19,9 | 1,1 | 27,0 |
3 | 1 | 2 | 12 | 3 | 36 | 2 | 44 |
3 | 1 | 3 | 16 | 3 | 38 | 2 | 52 |
3 | 2 | 0 | 9,3 | 1,8 | 36,0 | 1,2 | 43,0 |
3 | 2 | 1 | 15 | 3 | 38 | 2 | 52 |
3 | 2 | 2 | 21 | 3 | 40 | 2 | 56 |
3 | 2 | 3 | 29 | 9 | 99 | 5 | 152 |
3 | 3 | 0 | 24 | 4 | 99 | 5 | 152 |
3 | 3 | 1 | 46 | 9 | 198 | 5 | 283 |
3 | 3 | 2 | 110 | 20 | 400 | 10 | 570 |
3 | 3 | 3 | > 110 |
Методические указания МУК 4.2.2428-08 “Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста” (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 октября 2008 г.)
Текст методических указаний приводится по официальному изданию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Москва, 2008 г.