Продукты и услуги Информационно-правовое обеспечение ПРАЙМ Документы ленты ПРАЙМ Методические указания МУК 4.1.2479-09 "Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Методические указания МУК 4.1.2479-09 "Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Справка

Методические указания МУК 4.1.2479-09
"Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах"
(утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введены впервые

Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в пищевых продуктах массовых концентраций пентахлорфенола (ПХФ) в диапазоне 0,005-1,0 мг/кг.

Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящиеся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.

Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1. Краткая характеристика пентахлорфенола

Общепринятое название: пентахлорфенол (ПХФ).

Название по номенклатуре ИЮПАК: 2,3,4,5,6-пентахлорфенол.

Синонимы: пентахлорфенол, 1-гидроксипентахлорбензол, хлорофен, пенхлорол, пента.

Структурная формула:

Рис 1.bmp

Эмпирическая формула: *. М.м. 266,34

CAS номер: 87-86-5

Физические свойства: белый или слегка коричневатый порошок, с характерным фенольным запахом, температура плавления 190.С, температура кипения 310.С, плотность D 1.978 *, константа диссоциации рКа 4,7. Растворим в большинстве органических растворителях#: ацетон (500 г/л), бензол (150 г/л), этанол (1200 г/л), метанол (1800 г/л); мало растворим в воде (2 г/л). Растворим в маслах.

Форма выпуска: порошок.

Область применения. ПХФ используют в качестве фунгицида, бактерицида, гербицида, инсектицида, а также как консервант древесины.

Токсичность. Высоко токсичное соединение: при оральном введении крысам * составляет 27 мг/кг. При контакте с кожей появляются белые пятна; ингаляция вызывает сильную головную боль, усталость, утомляемость, потливость, жажду, обмороки, повышение температуры тела.

Гигиенические нормативы. Согласно европейским стандартам содержание ПХФ в воде не должно превышать 9,0 нг/л (WHO, 2001). Установленное U.S.ЕРА суточное потребление при оральном поступлении ПХФ, вызывающее минимальный риск для здоровья человека, составляет 0,005 мг/кг/сутки, а при хроническом его потреблении - 0,001 мг/кг/сутки.

Рекомендуемый гигиенический норматив для Российской Федерации: содержание пентахлорфенола в пищевых продуктах не допускается (на уровне предела обнаружения метода).

2. Методика определения ПХФ в продуктах питания методом газо-жидкостной хроматографии
Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении ПХФ в продуктах питания методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием электронзахватного детектора (ЭЗД) после экстракции ПХФ из подкисленной анализируемой пробы органическим растворителем, переэкстракции ПХФ в водную фазу при подщелачивании, подкислении пробы и вновь экстракции ПХФ органическим растворителем. Количественное определение проводится методом внутреннего стандарта после метилирования диазометаном. В качестве внутреннего стандарта используется альдрин.

2.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций ПХФ в пробе

Таблица 1

+-----------------------------------------------------------------------+
.    Метрологические характеристики     .   Концентрация ПХФ в пробе    .
.                                       +-------------------------------.
.                                       .0,01-0,5 мг/кг .  > 0,5 мг/кг  .
+---------------------------------------+---------------+---------------.
.Границы относительной погрешности      .    +-18.18    .    +-13,09    .
.(показатель точности) (+-дельта), %, Р .               .               .
.= 0,95                                 .               .               .
+---------------------------------------+---------------+---------------.
.Стандартное отклонение повторяемости   .     0,005     .     0,139     .
.(сигма r), мг/кг                       .               .               .
+---------------------------------------+---------------+---------------.
.Предел повторяемости (r), мг/кг        .     0,013     .     0,385     .
+---------------------------------------+-------------------------------.
.Предел обнаружения, мг/кг              .             0,001             .
+---------------------------------------+-------------------------------.
.Полнота извлечения веществ, %          .     75.8      .     88,3      .
+-----------------------------------------------------------------------+

______________________________

* - Метрологические характеристики рассчитаны для образцов с содержанием пентахлорфенола 0,02 мг/кг и 1,0 мг/кг.

Реактивы

н-Гексан, х.ч., по ТУ 6-09-4521-84;

Этиловый эфир, ОСТ 84-2006-88;

Трихлорметан, х.ч. по ТУ 6-09-4263-76;

Гидразин-гидрат, ч.д.а., ГОСТ 5832-65;

Кали едкое, Lachema, Чехия;

Тетраборат натрия, декагидрат, ч, ГОСТ 8429-77;

Натрий сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77, концентрацией 17,91 моль/л;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;

Пентахлорфенол, "PolyScience Corporation", США;

ГСО 7296-96 альдрина, Государственный инженерный центр "РЕАКТИВ", стандартный образец в ацетоне концентрацией 0,1 мг/мл.

Приборы, аппаратура, посуда

Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и инжектором с делением потока "split-splitless injector" для капиллярной колонки;

Капиллярная колонка с жидкой фазой DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или НР-5, длина колонки 30-50 м, внутренний диаметр колонки - 0,2 - 0,32 мм, толщина пленки жидкой фазы - 2-5 мкм;

Система ГЖХ-МС: масс-спектрометр Polaris-Q фирмы Finnigan (США);

Интегратор или другой регистрирующий прибор;

Баллон с сжатым азотом квалификации ос.ч.;

Микрошприцы МШ-10 и аналогичные (Hamilton, США);

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78;

Центрифуга OПн-8УХЛ 4.2., ТУ5.375-4261-76;

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью * г.

Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный, ТУ 25-11-917;

Дистиллятор

Блендер

Воронка делительная на 100 * по ГОСТ 10054;

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770;

Колбы плоскодонные по ГОСТ 25336 с конусом 14/23 вместимостью 100 *;

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 100 *;

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227;

Вайл (емкость вместимостью 4-6 * с герметично завинчивающейся крышкой);

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "Синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157-98;

Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.

Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

Перед анализом пробу образца перемалывают на мясорубке или в кофемолке и тщательно перемешивают в блендере.

Подготовка к определению

2.5.1. Приготовление стандартных растворов ПХФ

Навеску * г кристаллического ПХФ количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 *, растворяют в 150 * гексана, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в гексане с массовой долей ПХФ 0,01 *;

Для получения рабочих стандартных растворов последовательно разбавляют основной стандартный раствор гексаном. Для этого аликвоты 5,0, 2,0, 1,0 и 0,1 * помещают в мерные колбы вместимостью 100 * и растворы доводят гексаном до метки; получают рабочие стандартные растворы с содержанием ПХФ 0,0005, 0,0002, 0,0001 и 0,00001 *, соответственно.

Основной и рабочие стандартные растворы ПХФ хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0.С). Сроки годности основного и рабочих стандартных растворов год.

2.5.2. Получение диазометана

Диазометан получают по следующей методике. В реакционную колбу прибора (рис. 1) помещают 6 г гидроксида калия, добавляют 3 * метанола и 3 * гидразин гидрата. В приемную колбу наливают 50 * диэтилового эфира. При включенной через холодильник воде из воронки прикапывают со скоростью 1 капля за 1-2 секунды хлороформ. Окончание реакции получения диазометана определяют по появлению белых паров или бурой окраски реакционной смеси. Эфирный раствор диазометана интенсивно-желтого цвета хранят в герметично закрытой темной стеклянной посуде на холоду в течение 3-5 дней.

2.5.3. Приготовление рабочих стандартных растворов метиловых эфиров ПХФ

По 0,5 * рабочих стандартных растворов ПХФ помещают в вайлы, растворитель упаривают досуха в токе азота, к остатку добавляют по 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания растворы досуха упаривают в токе азота и остаток растворяют в 0,2 * гексана. Полученный раствор используют для построения калибровочной кривой (рис. 2).

2.5.4. Приготовление калибровочной смеси стандартных растворов метилового эфира ПХФ и альдрина (внутренний стандарт).

1 * ГСО альдрина помещают в мерную колбу вместимостью 1000 *, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор альдрина концентрацией 0,0001 *.

В вайл помещают 0,5 * рабочего стандартного раствора ПХФ концентрацией 0,0001 * (50 нг). Растворитель упаривают досуха в токе азота, к сухому остатку добавляют 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота, к сухому остатку добавляют 0,2 * стандартного раствора альдрина (20 нг) и растворитель вновь упаривают в токе азота досуха. Полученный остаток растворяют в 0,2 * гексана. Полученный раствор используют для калибровки хроматографа.

2.5.5. Подготовка пробы пищевого продукта для анализа

2.5.5.1. Приготовление 0,1М раствора тетрабората натрия.

Навеску * г тетрабората натрия декагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 *, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения соли, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор буры концентрацией 0,1М.

2.5.5.2. Приготовление 3,0М раствора серной кислоты.

Мерную колбу вместимостью 100 * до половины заполняют дистиллированной водой. Добавляют 16,75 * концентрированной серной кислоты, раствор взбалтывают, доводят до комнатной температуры и водой доводят до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор серной кислоты концентрацией 3,0М.

2.5.5.3. Подготовка образца

Навеску * г измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 *, добавляют 10 * дистиллированной воды, 10 * концентрированной серной кислоты и 10 * смеси гексан-изопропанол (4:1). Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут, переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 минут при 2000 об./мин. и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды с 10 * смеси гексан-изопропанол (4:1) при встряхивании и центрифугировании. Гексановые экстракты объединяют.

Объединенный гексановый экстракт помещают в делительную воронку вместимостью 100 *, добавляют 10 * 0,1М раствора тетрабората натрия (бура) и смесь встряхивают. Отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды по 10 * раствора буры. Объединенный водный экстракт при необходимости центрифугируют и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 *, подкисляют 3 * 3М раствора серной кислоты и ПХФ экстрагируют гексаном 3 раза по 10 *. Гексановый экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, порциями фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" или, при необходимости, фильтруют через нейлоновый фильтр в вайл и растворитель упаривают досуха в токе азота.

2.5.5.4. Получение метилового производного ПХФ из экстракта пищевого продукта

К полученному сухому остатку добавляют по 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют 0,2 * стандартного раствора альдрина концентрацией 0,0001 * (20 нг, внутренний стандарт), растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 * гексана.

2.6. Описание определения

2.6.1. Условия ГЖХ анализа.

Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.

Условия ГЖХ: кварцевая капиллярная колонка 50 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза полиметилфенилсилоксан (5% фенила) DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или НР-5:

температура колонки 250.С;

температура испарителя 280.С;

температура детектора 300.С;

время выхода растворителя 2,5-3 мин (для колонки 50 м).

2.6.2. Анализ пробы.

Анализ проводят в условиях ГЖХ, описанных в п. 2.6.1.

В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца вместимостью 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,0005-0,001 *) калибровочной смеси метилового эфира ПХФ и альдрина. При использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматограф точные количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя гексана и времена выхода метил-ПХФ и альдрина. Определяют относительное приведенное время удерживания (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков стандарта и внутреннего стандарта (*. и *.). Относительные приведенные времена удерживания определяют по следующей формуле:

*, где

* - относительное приведенное время удерживания, мин.,

to - время удерживания растворителя, мин.,

* - время удерживания метил-ПХФ, мин.,

* - время удерживания альдрина, мин.

Площадь пиков определяют по показанию интегратора.

Затем в газовый хроматограф вводят 0,0005-0,001 * раствора, полученного по п. 2.5.5.4. При наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени удерживания метил-ПХФ, определяют его площадь (*). Относительное приведенное время удерживания метил-ПХФ в зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,48-0,51.

Абсолютные времена удерживания ПХФ в приведенных условиях - * минут для метилового эфира ПХФ и * - для альдрина (внутренний стандарт) (рис. 3).

2.6.3. Подтверждение результатов определения с помощью метода ГЖХ-МС.

Анализ ГЖХ-МС проводили на приборе Polaris-Q фирмы Finnigan (США) при следующих условиях: ГЖХ - капиллярная колонка длиной 30 м х 0,25 мм с неподвижной фазой DB-5 при программировании температуры: начальная температура 60.С, 1 минута - 250.С, 25.С/мин, 1 минута - 280.С, 5.С/мин.; газ-носитель гелий - 1 мл/мин. Температура инжектора 280.С, интерфейса ГЖХ-МС - 250.С. Условия МС: "ионная ловушка", сканирование в режиме полного ионного тока от 39 m/z до 550 m/z. Температура ионной коробочки 250.С. В результате исследования на хроматограмме получен пик с молекулярным ионом *=280 (70%) и фрагментами с m/z 265 (100%), 237 (82%) с соответствующими изотопными хлорсодержащими пиками.

Таким образом, масс-спектр исследуемого соединения как по библиотечному поиску, так и по правилам фрагментации соответствует метильному производному ПХФ, масс-спектр которого приведен на рис. 4.

2.7. Обработка результатов измерения

2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой

Хроматографируют по 0,001 * каждого рабочего раствора метилового эфира ПХФ (п. 2.5.3.). Хроматографирование проводят трижды и строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации ПХФ в * (приложение 1).

2.7.2. Оформление результатов.

Расчет содержания ПХФ в анализируемой смеси проводят по формуле:

* (1)

М - масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг,

* - масса введенного внутреннего стандарта (альдрин), мкг, (0,02 мкг),

S - площадь пика анализируемого вещества (ПХФ),

* - площадь пика внутреннего стандарта (альдрин),

К - поправочный коэффициент вещества (метил-ПХФ) по внутреннему стандарту (альдрин), (формула 2).

Поправочный коэффициент определяют в соответствии с параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:

* (2)

где m - масса ПХФ, нг, (50 нг),

* - масса альдрина, нг, (20 нг),

* - площадь альдрина,

S - площадь метил-ПХФ,

Пересчет количества ПХФ на кг исследуемого продукта проводят следующим образом:

*

где * - содержание ПХФ, мг/кг,

М - масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг, (формула 1),

m - масса анализируемой пробы, г, (1 г).

3. Оперативный контроль результатов измерений

3.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Для устранения инструментальных ошибок при газовой хроматографии (постоянство температуры колонки, скорости и деления потока газа и др.) применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют вещество с близкими физико-химическими и хроматографическими характеристиками (альдрин). При анализе в каждую пробу добавляют точно известное количество альдрина. Хроматографирование проводят дважды, сравнивают отношение площади пика исследуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта и результат считают удовлетворительным, если эта величина не превышает 5%.

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (таблица 1):

*, мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

*

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя новую пробу.

3.2. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов и БАД. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандарта ПХФ, такое количество, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (*) и пробы с добавкой (*). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (*), пробы без добавки (*) и величиной добавки (*) с нормативом оперативного контроля (К). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р = 0,95):

*

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90):

*

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

4. Требования техники безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5. Требования к квалификации операторов

Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).

6. Условия измерений

Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.

Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25.С. Относительная влажность воздуха не более 80% при 25.С. Атмосферное давление 730-760 мм рт. ст. Напряжение электропитания 210-220 В. Частота переменного тока 45-50 Гц.

Рис. 1. Прибор для получения диазометана

Ris_1.bmp

Рис. 2. Пример градуировочной зависимости для определения пентахлорфенола

Ris_2.bmp

Рис. 3. Пример хромофотограммы калибровочной смеси: пентахлорфенол (время удерживания 11,2, мин); альдрин (время удерживания 20,7 мин.)

Ris_3.bmp

Рис. 4. Масс-спектр метильного производного пентахлорфенола

Ris_4.bmp


Методические указания МУК 4.1.2479-09. Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Текст документа приводится по официальному изданию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 2009 г.)

1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, К.И. Эллер, В.В. Пименова, М.Г. Киселева, С.В. Волкович, Ю.В. Медведев)

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3)

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 02 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с момента утверждения

5. Введены впервые

Для просмотра актуального текста документа и получения полной информации о вступлении в силу, изменениях и порядке применения документа, воспользуйтесь поиском в Интернет-версии системы ГАРАНТ: