Методические указания МУК 4.1.2479-09 "Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Методические указания МУК 4.1.2479-09
"Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах"
(утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые
Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в пищевых продуктах массовых концентраций пентахлорфенола (ПХФ) в диапазоне 0,005-1,0 мг/кг.
Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящиеся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.
Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1. Краткая характеристика пентахлорфенола
Общепринятое название: пентахлорфенол (ПХФ).
Название по номенклатуре ИЮПАК: 2,3,4,5,6-пентахлорфенол.
Синонимы: пентахлорфенол, 1-гидроксипентахлорбензол, хлорофен, пенхлорол, пента.
Структурная формула:
Рис 1.bmp
Эмпирическая формула: *. М.м. 266,34
CAS номер: 87-86-5
Физические свойства: белый или слегка коричневатый порошок, с характерным фенольным запахом, температура плавления 190.С, температура кипения 310.С, плотность D 1.978 *, константа диссоциации рКа 4,7. Растворим в большинстве органических растворителях#: ацетон (500 г/л), бензол (150 г/л), этанол (1200 г/л), метанол (1800 г/л); мало растворим в воде (2 г/л). Растворим в маслах.
Форма выпуска: порошок.
Область применения. ПХФ используют в качестве фунгицида, бактерицида, гербицида, инсектицида, а также как консервант древесины.
Токсичность. Высоко токсичное соединение: при оральном введении крысам * составляет 27 мг/кг. При контакте с кожей появляются белые пятна; ингаляция вызывает сильную головную боль, усталость, утомляемость, потливость, жажду, обмороки, повышение температуры тела.
Гигиенические нормативы. Согласно европейским стандартам содержание ПХФ в воде не должно превышать 9,0 нг/л (WHO, 2001). Установленное U.S.ЕРА суточное потребление при оральном поступлении ПХФ, вызывающее минимальный риск для здоровья человека, составляет 0,005 мг/кг/сутки, а при хроническом его потреблении - 0,001 мг/кг/сутки.
Рекомендуемый гигиенический норматив для Российской Федерации: содержание пентахлорфенола в пищевых продуктах не допускается (на уровне предела обнаружения метода).
2. Методика определения ПХФ в продуктах питания методом газо-жидкостной хроматографии
Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении ПХФ в продуктах питания методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием электронзахватного детектора (ЭЗД) после экстракции ПХФ из подкисленной анализируемой пробы органическим растворителем, переэкстракции ПХФ в водную фазу при подщелачивании, подкислении пробы и вновь экстракции ПХФ органическим растворителем. Количественное определение проводится методом внутреннего стандарта после метилирования диазометаном. В качестве внутреннего стандарта используется альдрин.
2.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций ПХФ в пробе
Таблица 1
+-----------------------------------------------------------------------+ . Метрологические характеристики . Концентрация ПХФ в пробе . . +-------------------------------. . .0,01-0,5 мг/кг . > 0,5 мг/кг . +---------------------------------------+---------------+---------------. .Границы относительной погрешности . +-18.18 . +-13,09 . .(показатель точности) (+-дельта), %, Р . . . .= 0,95 . . . +---------------------------------------+---------------+---------------. .Стандартное отклонение повторяемости . 0,005 . 0,139 . .(сигма r), мг/кг . . . +---------------------------------------+---------------+---------------. .Предел повторяемости (r), мг/кг . 0,013 . 0,385 . +---------------------------------------+-------------------------------. .Предел обнаружения, мг/кг . 0,001 . +---------------------------------------+-------------------------------. .Полнота извлечения веществ, % . 75.8 . 88,3 . +-----------------------------------------------------------------------+
______________________________
* - Метрологические характеристики рассчитаны для образцов с содержанием пентахлорфенола 0,02 мг/кг и 1,0 мг/кг.
Реактивы
н-Гексан, х.ч., по ТУ 6-09-4521-84;
Этиловый эфир, ОСТ 84-2006-88;
Трихлорметан, х.ч. по ТУ 6-09-4263-76;
Гидразин-гидрат, ч.д.а., ГОСТ 5832-65;
Кали едкое, Lachema, Чехия;
Тетраборат натрия, декагидрат, ч, ГОСТ 8429-77;
Натрий сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77, концентрацией 17,91 моль/л;
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;
Пентахлорфенол, "PolyScience Corporation", США;
ГСО 7296-96 альдрина, Государственный инженерный центр "РЕАКТИВ", стандартный образец в ацетоне концентрацией 0,1 мг/мл.
Приборы, аппаратура, посуда
Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и инжектором с делением потока "split-splitless injector" для капиллярной колонки;
Капиллярная колонка с жидкой фазой DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или НР-5, длина колонки 30-50 м, внутренний диаметр колонки - 0,2 - 0,32 мм, толщина пленки жидкой фазы - 2-5 мкм;
Система ГЖХ-МС: масс-спектрометр Polaris-Q фирмы Finnigan (США);
Интегратор или другой регистрирующий прибор;
Баллон с сжатым азотом квалификации ос.ч.;
Микрошприцы МШ-10 и аналогичные (Hamilton, США);
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78;
Центрифуга OПн-8УХЛ 4.2., ТУ5.375-4261-76;
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью * г.
Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный, ТУ 25-11-917;
Дистиллятор
Блендер
Воронка делительная на 100 * по ГОСТ 10054;
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770;
Колбы плоскодонные по ГОСТ 25336 с конусом 14/23 вместимостью 100 *;
Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 100 *;
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227;
Вайл (емкость вместимостью 4-6 * с герметично завинчивающейся крышкой);
Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 "Синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157-98;
Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC.
Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.
Отбор проб
Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.
Перед анализом пробу образца перемалывают на мясорубке или в кофемолке и тщательно перемешивают в блендере.
Подготовка к определению
2.5.1. Приготовление стандартных растворов ПХФ
Навеску * г кристаллического ПХФ количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 *, растворяют в 150 * гексана, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в гексане с массовой долей ПХФ 0,01 *;
Для получения рабочих стандартных растворов последовательно разбавляют основной стандартный раствор гексаном. Для этого аликвоты 5,0, 2,0, 1,0 и 0,1 * помещают в мерные колбы вместимостью 100 * и растворы доводят гексаном до метки; получают рабочие стандартные растворы с содержанием ПХФ 0,0005, 0,0002, 0,0001 и 0,00001 *, соответственно.
Основной и рабочие стандартные растворы ПХФ хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0.С). Сроки годности основного и рабочих стандартных растворов год.
2.5.2. Получение диазометана
Диазометан получают по следующей методике. В реакционную колбу прибора (рис. 1) помещают 6 г гидроксида калия, добавляют 3 * метанола и 3 * гидразин гидрата. В приемную колбу наливают 50 * диэтилового эфира. При включенной через холодильник воде из воронки прикапывают со скоростью 1 капля за 1-2 секунды хлороформ. Окончание реакции получения диазометана определяют по появлению белых паров или бурой окраски реакционной смеси. Эфирный раствор диазометана интенсивно-желтого цвета хранят в герметично закрытой темной стеклянной посуде на холоду в течение 3-5 дней.
2.5.3. Приготовление рабочих стандартных растворов метиловых эфиров ПХФ
По 0,5 * рабочих стандартных растворов ПХФ помещают в вайлы, растворитель упаривают досуха в токе азота, к остатку добавляют по 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире.
Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания растворы досуха упаривают в токе азота и остаток растворяют в 0,2 * гексана. Полученный раствор используют для построения калибровочной кривой (рис. 2).
2.5.4. Приготовление калибровочной смеси стандартных растворов метилового эфира ПХФ и альдрина (внутренний стандарт).
1 * ГСО альдрина помещают в мерную колбу вместимостью 1000 *, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор альдрина концентрацией 0,0001 *.
В вайл помещают 0,5 * рабочего стандартного раствора ПХФ концентрацией 0,0001 * (50 нг). Растворитель упаривают досуха в токе азота, к сухому остатку добавляют 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота, к сухому остатку добавляют 0,2 * стандартного раствора альдрина (20 нг) и растворитель вновь упаривают в токе азота досуха. Полученный остаток растворяют в 0,2 * гексана. Полученный раствор используют для калибровки хроматографа.
2.5.5. Подготовка пробы пищевого продукта для анализа
2.5.5.1. Приготовление 0,1М раствора тетрабората натрия.
Навеску * г тетрабората натрия декагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 *, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения соли, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор буры концентрацией 0,1М.
2.5.5.2. Приготовление 3,0М раствора серной кислоты.
Мерную колбу вместимостью 100 * до половины заполняют дистиллированной водой. Добавляют 16,75 * концентрированной серной кислоты, раствор взбалтывают, доводят до комнатной температуры и водой доводят до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор серной кислоты концентрацией 3,0М.
2.5.5.3. Подготовка образца
Навеску * г измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 *, добавляют 10 * дистиллированной воды, 10 * концентрированной серной кислоты и 10 * смеси гексан-изопропанол (4:1). Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут, переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 минут при 2000 об./мин. и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды с 10 * смеси гексан-изопропанол (4:1) при встряхивании и центрифугировании. Гексановые экстракты объединяют.
Объединенный гексановый экстракт помещают в делительную воронку вместимостью 100 *, добавляют 10 * 0,1М раствора тетрабората натрия (бура) и смесь встряхивают. Отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды по 10 * раствора буры. Объединенный водный экстракт при необходимости центрифугируют и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 *, подкисляют 3 * 3М раствора серной кислоты и ПХФ экстрагируют гексаном 3 раза по 10 *. Гексановый экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, порциями фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" или, при необходимости, фильтруют через нейлоновый фильтр в вайл и растворитель упаривают досуха в токе азота.
2.5.5.4. Получение метилового производного ПХФ из экстракта пищевого продукта
К полученному сухому остатку добавляют по 1,0 * насыщенного раствора диазометана в эфире.
Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют 0,2 * стандартного раствора альдрина концентрацией 0,0001 * (20 нг, внутренний стандарт), растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 * гексана.
2.6. Описание определения
2.6.1. Условия ГЖХ анализа.
Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.
Условия ГЖХ: кварцевая капиллярная колонка 50 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза полиметилфенилсилоксан (5% фенила) DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или НР-5:
температура колонки 250.С;
температура испарителя 280.С;
температура детектора 300.С;
время выхода растворителя 2,5-3 мин (для колонки 50 м).
2.6.2. Анализ пробы.
Анализ проводят в условиях ГЖХ, описанных в п. 2.6.1.
В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца вместимостью 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,0005-0,001 *) калибровочной смеси метилового эфира ПХФ и альдрина. При использовании метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматограф точные количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя гексана и времена выхода метил-ПХФ и альдрина. Определяют относительное приведенное время удерживания (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков стандарта и внутреннего стандарта (*. и *.). Относительные приведенные времена удерживания определяют по следующей формуле:
*, где
* - относительное приведенное время удерживания, мин.,
to - время удерживания растворителя, мин.,
* - время удерживания метил-ПХФ, мин.,
* - время удерживания альдрина, мин.
Площадь пиков определяют по показанию интегратора.
Затем в газовый хроматограф вводят 0,0005-0,001 * раствора, полученного по п. 2.5.5.4. При наличии пика, соответствующего относительному приведенному времени удерживания метил-ПХФ, определяют его площадь (*). Относительное приведенное время удерживания метил-ПХФ в зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,48-0,51.
Абсолютные времена удерживания ПХФ в приведенных условиях - * минут для метилового эфира ПХФ и * - для альдрина (внутренний стандарт) (рис. 3).
2.6.3. Подтверждение результатов определения с помощью метода ГЖХ-МС.
Анализ ГЖХ-МС проводили на приборе Polaris-Q фирмы Finnigan (США) при следующих условиях: ГЖХ - капиллярная колонка длиной 30 м х 0,25 мм с неподвижной фазой DB-5 при программировании температуры: начальная температура 60.С, 1 минута - 250.С, 25.С/мин, 1 минута - 280.С, 5.С/мин.; газ-носитель гелий - 1 мл/мин. Температура инжектора 280.С, интерфейса ГЖХ-МС - 250.С. Условия МС: "ионная ловушка", сканирование в режиме полного ионного тока от 39 m/z до 550 m/z. Температура ионной коробочки 250.С. В результате исследования на хроматограмме получен пик с молекулярным ионом *=280 (70%) и фрагментами с m/z 265 (100%), 237 (82%) с соответствующими изотопными хлорсодержащими пиками.
Таким образом, масс-спектр исследуемого соединения как по библиотечному поиску, так и по правилам фрагментации соответствует метильному производному ПХФ, масс-спектр которого приведен на рис. 4.
2.7. Обработка результатов измерения
2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой
Хроматографируют по 0,001 * каждого рабочего раствора метилового эфира ПХФ (п. 2.5.3.). Хроматографирование проводят трижды и строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации ПХФ в * (приложение 1).
2.7.2. Оформление результатов.
Расчет содержания ПХФ в анализируемой смеси проводят по формуле:
* (1)
М - масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг,
* - масса введенного внутреннего стандарта (альдрин), мкг, (0,02 мкг),
S - площадь пика анализируемого вещества (ПХФ),
* - площадь пика внутреннего стандарта (альдрин),
К - поправочный коэффициент вещества (метил-ПХФ) по внутреннему стандарту (альдрин), (формула 2).
Поправочный коэффициент определяют в соответствии с параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:
* (2)
где m - масса ПХФ, нг, (50 нг),
* - масса альдрина, нг, (20 нг),
* - площадь альдрина,
S - площадь метил-ПХФ,
Пересчет количества ПХФ на кг исследуемого продукта проводят следующим образом:
*
где * - содержание ПХФ, мг/кг,
М - масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг, (формула 1),
m - масса анализируемой пробы, г, (1 г).
3. Оперативный контроль результатов измерений
3.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
Для устранения инструментальных ошибок при газовой хроматографии (постоянство температуры колонки, скорости и деления потока газа и др.) применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют вещество с близкими физико-химическими и хроматографическими характеристиками (альдрин). При анализе в каждую пробу добавляют точно известное количество альдрина. Хроматографирование проводят дважды, сравнивают отношение площади пика исследуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта и результат считают удовлетворительным, если эта величина не превышает 5%.
Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (таблица 1):
*, мг/кг
Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:
*
то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
При превышении норматива R следует повторить измерения, используя новую пробу.
3.2. Контроль качества результатов измерений
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов и БАД. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандарта ПХФ, такое количество, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (*) и пробы с добавкой (*). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.
Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (*), пробы без добавки (*) и величиной добавки (*) с нормативом оперативного контроля (К). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р = 0,95):
*
Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90):
*
При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.
4. Требования техники безопасности
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
5. Требования к квалификации операторов
Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).
6. Условия измерений
Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.
Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25.С. Относительная влажность воздуха не более 80% при 25.С. Атмосферное давление 730-760 мм рт. ст. Напряжение электропитания 210-220 В. Частота переменного тока 45-50 Гц.
Рис. 1. Прибор для получения диазометана
Ris_1.bmp
Рис. 2. Пример градуировочной зависимости для определения пентахлорфенола
Ris_2.bmp
Рис. 3. Пример хромофотограммы калибровочной смеси: пентахлорфенол (время удерживания 11,2, мин); альдрин (время удерживания 20,7 мин.)
Ris_3.bmp
Рис. 4. Масс-спектр метильного производного пентахлорфенола
Ris_4.bmp
Методические указания МУК 4.1.2479-09. Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Текст документа приводится по официальному изданию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 2009 г.)
1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, К.И. Эллер, В.В. Пименова, М.Г. Киселева, С.В. Волкович, Ю.В. Медведев)
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3)
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 02 февраля 2009 г.
4. Введены в действие с момента утверждения
5. Введены впервые