Методические указания МУК 4.1.2480-09 "Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах" (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Методические указания МУК 4.1.2480-09
"Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах"
(утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые
Настоящие методические указания устанавливают методику определения дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящиеся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.
Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1. Краткая характеристика препарата
Общепринятое название: дорамектин, ветранал.
Название по номенклатуре ИЮПАК: 25-циклогексил-5-О-диметил-25-ди(1-метил-пропил) авермектин. CAS: 117704-25-3.
Структурная формула:
Рис. 1.bmp
Эмпирическая формула: *, М.м. 899,11.
Физические свойства: белый порошок, без запаха. Хорошо растворим в ацетонитриле.
Торговая марка: эндектоцид "Дектомакс" ("Dectomax").
Фирма-производитель: "Pfizer",.
Форма выпуска: 1% раствор дорамектина в растительном масле.
Область применения. "Дектомакс" используется в качестве противопаразитарного средства широкого спектра действия для лечения и профилактики заболеваний крупного рогатого скота, овец и свиней. Средство предназначено для парентерального введения крупному рогатому скоту.
2. Методика определения остаточных количеств дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием (* нм, * - 470 нм) после экстракции дорамектина из образца. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
2.1.2. Метрологические характеристики метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Таблица 1
Метрологические параметры методики определения дорамектина в тканях сельскохозяйственных животных (р = 0,95, n = 10)
+-----------------------------------------------------------------------+ . Анализируемый объект . Мышечная ткань, печень, . . . почки, жир . +--------------------------------------------+--------------------------. .Диапазон загрязнения, мг/кг . 0,003-0,1 . 0,1-2,5 . +--------------------------------------------+--------------------------. .Предел обнаружения, мг/кг . 0,001 . +--------------------------------------------+--------------------------. .Среднее значение степени извлечения, % . 71,5 . 84,6 . +--------------------------------------------+-----------+--------------. .Стандартное отклонение повторяемости, Sr, . 0,017 . 0,078 . .мг/кг (в % от среднего значения) . (22,6) . (15,6) . +--------------------------------------------+-----------+--------------. .Предел повторяемости, r, мг/кг (в % от . 0,047 . 0,217 . .среднего значения) . (62,6) . (43,4) . +--------------------------------------------+-----------+--------------. .Предел относительной погрешности результата . 25,5 . 13,4 . .анализа, +-дельта, % . . . +-----------------------------------------------------------------------+
2.2. Реактивы
Ацетонитрил, квалификации "для ВЭЖХ";
Тетрагидрофуран, квалификации "ос.ч.";
Метанол, квалификации "для ВЭЖХ";
н-Гексан, квалификации "х.ч.", по ТУ 6-09-4521;
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
Натрия гидроокись, квалификации "ос.ч." по ГОСТ 4328;
Аммиак водный (25-30% *) квалификации "ос.ч." по ГОСТ 24147;
Триэтиламин, *% (Sigma), CAS: 121-44-8;
Трифторуксусный ангидрид, *% (Sigma);
Дорамектин (UK-67,994), 91,9%, "Pfizer".
2.3. Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы
Хроматографическая система, состоящая из жидкостного хроматографа высокого давления, дегазатора, спектрофлюориметрического детектора и системы для сбора и обработки хроматографических данных.
Колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем * мм, 5 мкм (например, Phenomenex Luna C18 или аналогичная);
Микрошприц объемом 25 мкл для ВЭЖХ (Hamilton, США);
Шприц для инъекций, пластиковый, объемом 25 *;
Виалы стеклянные с закручивающейся крышкой "для автосамплера" (в крышке окошко, герметично закрытое резиновой вкладкой), объемом 2-4 *;
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451;
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью * г;
Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный, ТУ 25-11-917;
Блендер;
Баллон со сжатым азотом квалификации "ПНГ" по ГОСТ 9293;
Воронка делительная на 250 * по ГОСТ 25336
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770;
Колбы грушевидные по ГОСТ 25336 с конусом 14/23 вместимостью 100 *;
Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 100 *;
Пипетки 4(5)-1-2, 4(5)-2-10, 4(5)-2-25 по ГОСТ 29227;
Фильтры беззольные ФО-ФС-15 "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157;
Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб". Для длительного хранения образцы продуктов замораживаются и хранятся при -18.С до анализа.
Перед анализом образцы тщательно измельчают в гомогенизаторе или блендере.
2.5. Подготовка к проведению измерений
2.5.1. Приготовление подвижной фазы и кондиционирование хроматографической колонки
В мерную колбу вместимостью 1000 * помещают 530 * ацетонитрила, 270 * тетрагидрофурана, 200 * дистиллированной воды, тщательно перемешивают и выдерживают до комнатной температуры. Раствор дегазируют. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.
2.5.2. Приготовление стандартных растворов дорамектина
0,050_0,001 г кристаллического дорамектина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 *, растворяют в 50 * ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в ацетонитриле с массовой долей дорамектина 0,5 *.
Для построения градуировочной кривой методом последовательного разбавления ацетонитрилом готовят рабочие стандартные растворы с содержанием дорамектина 0,100, 0,010, 0,001 и 0,0001 *. Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40-45.С. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 *). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в *.
Основной и рабочие стандартные растворы дорамектина хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 4.С). Сроки годности основного раствора 12 месяцев, рабочих - 2 месяца.
2.5.3. Подготовка образца
Измельченный образец, массой 2,5 г помещают в 20 * ацетонитрила, закрывают емкость пробкой или парафильмом, помещают в теплую (40-50.С) ультразвуковую баню на 20-25 минут. Затем охлаждают, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 5 минут. Супернатант декантируют в делительную воронку и обезжиривают двумя порциями гексана по 10 *. Ацетонитрильный экстракт дорамектина собирают в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40-45.С.
2.5.4. Получение флуоресцирующего производного дорамектина
А.) Приготовление раствора аммиака в метаноле
В виалу (крышка герметичная с резиновой вкладкой, которую можно проколоть иглой) наливают 2-3 * метанола, крышку завинчивают. На пластиковый шприц для инъекций надевают иглу, вынимают поршень. Внутрь шприца помещают 4-6 гранул сухого гидроксида натрия, наливают водный аммиак и вставляют поршень. Шприц переворачивают вверх иглой, выделяющийся газ вытесняет из иглы воду, на иглу надевают виалу так, чтобы аммиак барботировал через метанол. Поршень шприца придерживают, насыщение происходит в течение 0,5-1 минуты. Перед каждым анализом рекомендуется готовить свежий раствор аммиака в метаноле.
Б.) Получение флуоресцирующего производного дорамектина
К остатку после упаривания аликвоты стандартного образца или пробы добавляют 0,15 * ацетонитрила, 0,1 * триэтиламина и 0,05 * трифторуксусного ангидрида, смесь перемешивают и отдувают в токе азота на водяной бане. К оставшемуся в колбе маслянистому содержимому добавляют 0,25 * свежеприготовленного 2М раствора аммиака в метаноле, снова отдувают в токе азота на водяной бане, добавляют к содержимому 0,4 * ацетонитрила (объем пробы V пр = 0,5 *). Аликвоту раствора образца V х (от 0,005 до 0,02 *) вводят в хроматограф.
2.6. Выполнение измерений
Условия хроматографического анализа.
Хроматографическая колонка: Колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем (например, Phenomenex Luna С18, * мм, 5 мкм);
Подвижная фаза:
ацетонитрил - 53%, тетрагидрофуран - 27%, вода - 20% об.;
Скорость подачи элюента: 1,0 *.
Детектирование: флюориметрическое, * = 360 нм, * - 470 нм.
Объем вводимой пробы 5-20 мм Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 - 125 нг дорамектина.
Абсолютное время удерживания дорамектина в приведенных условиях - * минут.
Хроматограмма образца сала, добавка дорамектина составляет 10 мкг/кг.
Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза, вычисляют среднюю площадь пика, соответствующего дорамектину.
Рис. 2.bmp
2.7. Обработка результатов измерения
2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой
Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40-45.С. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 *) (пункт 2.6.). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в *.
Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят при смене колонки и/или предколонки; при замене стандартного образца и/или реактивов; после проведения ремонта; после длительного простоя хроматографа (2 недели и более);
2.7.2. Оформление результатов
Содержание дорамектина можно рассчитать по градуировочному графику или методом внешнего стандарта. В последнем случае для расчетов используют стандартный раствор, площадь пика которого наиболее близка к площади пика дорамектина в образце. Для расчета по методу внешнего стандарта используют формулу:
*, где
Х - содержание дорамектина в пробе, мг/кг;
* - содержание дорамектина в стандартном растворе, *;
* - площадь пика дорамектина в анализируемом образце;
* - площадь пика стандарта;
* - объем аликвоты стандартного раствора дорамектина, *.
Vобр - объем образца (0,5 *)
* - объем образца, введенный в хроматограф (0,005-0,02 *)
3. Оперативный контроль результатов измерений
3.1. Контроль повторяемости результатов определения
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
*
где *, * - результаты параллельных определений, мг/кг;
* - предел относительной погрешности (таблица 1), в %.
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
4. Требования техники безопасности
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
5. Требования к квалификации операторов
Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями, а также с правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).
6. Условия измерений
Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.
Методические указания МУК 4.1.2480-09. Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)
Текст документа приводится по официальному изданию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 2009 г.)
1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН В.А. Тутельян, К.И. Эллер, М.Г. Киселева, Л.Г. Левин, Е.П. Хромченкова)
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25.12.2008 N 3)
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 02 февраля 2009 г.
4. Введены в действие с момента утверждения
5. Введены впервые